液相色譜HPLC是一類分離與分析技術(shù)，其特點是以液體作為流動相，利用混合物在液-固或不互溶的兩種液體之間分配比的差異,對混合物進行先分離,而后分析鑒定的儀器。液相色譜HPLC廣泛應(yīng)用到生物化學(xué)、食品分析、醫(yī)藥研究、環(huán)境分析、無機分析等各種領(lǐng)域。

1 維護液相色譜柱

①建議檢測前樣品和流動相進行過濾。
②建議每天做完樣品后及時進行清洗。
③常規(guī)檢測，測試完后直接把色譜柱反向連接采用90%有機相沖洗45min，最后保存在純甲醇或純乙腈中。
④使用緩沖鹽條件：
*等度條件：使用緩沖鹽之前和之后都用過渡流動相以1ml/min流速沖洗45min。
*梯度條件：使用緩沖鹽之前與初始流動相組成相同的過渡流動相以1ml/min流速沖洗45min。
注意：過渡流動相是指有機相和水相比例與分析流動相相同比例，只是不含有緩沖鹽。
*緩沖鹽沖洗干凈后，采用90%有機相反向沖洗60min，最后保存在純有機溶劑中。
注意：如果使用緩沖液不能存留色譜柱中過夜。

2 氨基柱使用一段時間后，柱效降低，峰形改變的恢復(fù)方法

用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0％NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當然要再用不含堿的流動相洗去多余氨)，之后再進行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如0.1％。

3 液相色譜中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因：

①篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。
②存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子。
③可能柱超載，減少進樣量。

4 HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法

①樣品量不足，解決辦法為增加樣品量。
②樣品未從柱子中流出，可根據(jù)樣品的化學(xué)性質(zhì)改變流動相或柱子。
③樣品與檢測器不匹配，根據(jù)樣品化學(xué)性質(zhì)調(diào)整波長或改換檢測器。
④檢測器衰減太多，調(diào)整衰減即可。
⑤檢測器時間常數(shù)太大，解決辦法為降低時間參數(shù)。
⑥檢測器池窗污染，解決辦法為清洗池窗。
⑦檢測池中有氣泡，解決辦法為排氣。
⑧記錄儀測壓范圍不當，調(diào)整電壓范圍即可。
⑨流動相流量不合適，調(diào)整流速即可。
⑩檢測器與記錄儀超出校正曲線，解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。

5 做HPLC分析時，柱壓不穩(wěn)定，找出原因并解決

①泵內(nèi)有空氣，解決的辦法是清除泵內(nèi)空氣，對溶劑進行脫氣處理。
②比例閥失效，更換比例閥即可。
③泵密封墊損壞，更換密封墊即可。
④溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法。
⑤系統(tǒng)檢漏，找出漏點，密封即可。
⑥梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。

6 HPLC柱驗收測試時柱壓過高是用戶常碰到的問題。

柱壓過高是HPLC柱用戶常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的問題。
①拆去保護預(yù)柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高，再檢查。
②把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞，需清洗，若壓力下降，再檢查。
③將柱子的進出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相沖洗柱子，（此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動池）。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查。只用于使用過的柱子。
④更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明您的溶劑或樣品含有顆粒雜質(zhì)，正是這些雜質(zhì)將篩板堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下，在進樣器與保護柱之間接一個在線過濾器便可避免柱壓過高的問題。

7 出現(xiàn)峰展寬的原因

①樣品體積過大：用流動相配樣，總的樣品體積小于第一峰的15%。
②在進樣閥中造成峰擴展:進樣前后排出氣泡以降低擴散。
③數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢:設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點。
④流動相粘度過高:增加柱溫，采用低粘度流動相。
⑤檢測池體積過大:用小體積池，卸下熱交換器。
⑥保留時間過長:等度洗脫時增加強溶劑含量，也可用梯度洗脫。
⑦柱外體積過大:將連接管徑和連接管長度降至最小。
⑧樣品過載:進小濃度小體積樣品。

8 避免流動相出現(xiàn)氣泡

①流動相溶液中往往因溶解有氧氣或空氣而形成氣泡。
②液路阻力比較大，吸液時出現(xiàn)了真空氣泡。
③系統(tǒng)開始工作時未能將流路中的空氣排除干凈。
④在注入樣品時混入了空氣。

9 常用的實驗室脫氣方式

①加熱回流脫氣，脫氣效果最佳，但無法保持。
②氦脫氣，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價格太貴，所以用的不多。
③真空脫氣，效果僅次于氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發(fā)損失。
④超聲脫氣，只能脫去約百分之三十的空氣，但在實驗室中最常用。目前還是盡量爭取用在線脫氣，方便且效果好。